เทคนิคเมื่อทำงานกับอาร์เอ็นเอ (RNA)

เมื่อปรียบเทียบการทำงานกับดีเอ็นเอแล้ว สำหรับอาร์เอ็นเอมีความท้าทายและข้อจำกัดกว่ามาก เนื่องจากดีเอ็นเอมีความเสถียรและถูกศึกษาโดยนักพันธุศาสตร์มาเป็นเวลานาน แต่อาร์เอ็นเอนั้นโครงสร้างทางเคมีมีแนวโน้มที่จะเกิดการไฮโดรไลซิส ทำให้มีเสถียรภาพน้อยลง ซึ่งทั้งดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอนั้นสามารถถูกทำลายโดยเอนไซม์ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส (DNase) ได้ แต่เอนไซม์ไรโบนิวคลีเอส (RNase) มีความเสถียรสูง ทำให้เกิดการเสียสภาพธรรมชาติของอาร์เอ็นเออย่างรุนแรง เอนไซม์ไรโบนิวคลีเอสมีความสำคัญในการปกป้องร่างกายจากไวรัสโดยถูกสร้างและปล่อยสู่ผิวหนัง เส้นผม และน้ำลาย ซึ่งสามารถปนเปื้อนลงไปในตัวอย่างขณะทำการทดลองได้ ในท้ายที่สุดแม้จะมีสารเคมีเรืองแสง (Fluorescence-based reagents) ในการวัดปริมาณและมองภาพดีเอ็นเอ แต่สำหรับอาร์เอ็นเอนั้นมีสารนี้ความไวต่ำหรือขาดความจำเพาะเมื่อมีดีเอ็นเอปนเปื้อน

คุณภาพอาร์เอ็นเอที่ดีเริ่มด้วยการสวมอุปกรณ์ป้องกันอันตรายส่วนบุคคล (PPE ; personal protective equipment)

ขณะทำงานกับอาร์เอ็นเอข้อสำคัญที่ต้องระวังคือหากต้องสัมผัสกับอะไรต้องสวมถุงมือก่อนเสมอ  หลีกเลี่ยงการสัมผัสใบหน้าหรือผมเพราะอาจทำให้ RNase จากผิวหนังไปยังถุงมือได้ เปลี่ยนถุงมือทุกครั้งหากสัมผัสกับอุปกรณ์อื่นที่ไม่สะอาด แนะนำให้สวมถุงมือใหม่เสมอก่อนส่งตัวอย่าง RNA บริสุทธิ์

ขจัดการปนเปื้อนของพื้นที่ทำงานและอุปกรณ์

ก่อนเริ่มทำงานกับอาร์เอ็นเอต้องทำความสะอาดพื้นที่ที่ใช้ทำงานก่อนตั้งแต่ โต๊ะที่ใช้ ปิเปต และอุปกรณ์อื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง บริษัท Biotium แนะนำให้ใช้ผลิตภัณฑ์สเปรย์ RNase-X™ Decontamination Solution โดยสเปรย์ผลิตภัณฑ์ลงบนพื้นผิว จากนั้นเช็ดออกแล้วพ่นด้วยน้ำ หรือเอทานอล 70% แล้วเช็ดอีกครั้ง ซึ่ง RNase-X™ มีประสิทธิภาพมากในการกำจัด RNases ออกจากพื้นผิว (ดังนี้)

รูปที่ 1 แสดงความสามารถของ RNase-X™ ในการกำจัด RNase ออกจากพื้นผิว เพื่อจำลองพื้นผิวที่ปนเปื้อน RNase ภายในหลอดทดลองจะเคลือบด้วย RNase A จากนั้นจะถูกชะล้างด้วยน้ำ หรือ RNase-X™ แล้วล้างออกด้วยน้ำ ตัวอย่างน้ำขั้นสุดท้ายถูกบ่มด้วย RNA ของมนุษย์ทั้งหมด จากนั้นจึงรันบนเจล agarose ด้วย EMBER500™ RNA Prestain Loading Dye แถวแรก : RNA บ่มกับน้ำอย่างเดียวแสดงให้เห็นว่ามีแบนของ ribosomal RNA ชัดเจน แถวตรงกลาง : RNA บ่มกับน้ำจาก RNase-treated จะเห็นว่า RNA ถูกทำลายไป แถวสุดท้าย : RNA บ่มกับน้ำจาก RNase-treated จะเห็นว่า RNase-X™ นั้นไม่ทำให้ RNA บุบสลาย เช่นเดียวกับกลุ่มควบคุม

วัสดุที่นำมาใช้ต้องปราศจากเอนไซม์ RNase

หลอดทดลอง ทิป น้ำ บัฟเฟอร์ และสารเคมีที่จะนำมาใช้กับอาร์เอ็นเอต้องทำฝห้ปราศจากเอนไซม์ RNase ก่อน ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการรับรองว่าปราศจากเอนไซม์ RNase นั้นสามารถซื้อได้จากหลายบริษัท (Biotium : Water, Ultrapure Molecular Biology Grade) สารละลายโฮมเมดที่ทำจากส่วนผสมคุณภาพสูงและน้ำบริสุทธิ์พิเศษมักปราศจาก RNase สามารถตรวจสอบได้โดยใช้การทดสอบ RNase เช่น RNaseAlert® โดยทั่วไปนิยมใช้สารละลายที่เป็นต้องบ่มกับ DEPC (diethyl pyrocarbonate) ที่กำจัดเอนไซม์ RNases แต่มีข้อเสียหลายอย่าง อาทิ ไม่สามารถใช้กับสารละลายที่มี Tris หรือสารละลายที่ประกอบด้วยอะมิโนอื่นๆ ได้ เพราะต้องนึ่งฆ่าเชื้อ และไม่อาจสามารถกำจัด RNases ได้ทั้งหมด DEPC ทำให้สารละลายมีความเป็นกรดเล็กน้อย และผลพลอยได้จาก DEPC อาจยับยั้งกระบวนการปลายน้ำ ดังนั้นเราอาจข้ามการใช้ DEPC และใช้สารอื่นที่ได้รับการยืนยันว่าไม่มี RNase จึงเหมาะสมกว่า

การจัดเก็บที่เหมาะสมจะรักษาอาร์เอ็นเอไว้ได้นาน

นอกเหนือจากการย่อยสลายของเอนไซม์ที่เกิดจาก RNases แล้วอาร์เอ็นเอยังอ่อนไหวต่อการไฮโดรไลซิสซึ่งเป็นปฏิกิริยาภายในโมเลกุลที่ทำให้กระดูกสันหลังฟอสโฟไดสเตอร์แตก การเติมสาร EDTA สามารถลดการสะลายของอาร์เอ็นเอได้ เพราะไอออนบวกที่มีวาเลนท์ เช่น Mg2+ จะเพิ่มการไฮโดรไลซิส การไฮโดรไลซิสของอาร์เอ็นเอนั้นแย่ลงในสารละลายอัลคาไลน์ ดังนั้นไม่ควรเก็บอาร์เอ็นเอในสารละลายที่มีค่า pH > 7.5 อาร์เอ็นเอจะมีความเสถียรเมื่อเก็บใน citrate buffer pH 6 หรือ TE buffer pH 7.5 ดังรูปที่ 2 อุณหภูมิก็มีความสำคัญอย่างมากต่อเสถียรภาพของอาร์เอ็นเอ หากต้องการจัดเก็บไว้เป็นเวลานานควรเก็บที่อุณหภูมิ  -70°C สำหรับการจัดเก็บระยะสั้นควรเก็บที่  4°C หรือ -20°C จะเก็บไว้ได้อย่างน้อย 3 สัปดาห์ (รูปที่ 2)

สารเพิ่มความคงตัวเพื่อยืดอายุอาร์เอ็นเอ

บางบริษัทได้ออกแบบผลิตภัณฑ์ที่อยู่จักกันในนาม RNAlater™ เพื่อเติมเข้าไปในชิ้นเนื้อหรือเซลล์ช่วยในการรักษาเสถียรภาพของอาร์เอ็นขณะทำงานและในการจัดเก็บ สารเพิ่มความคงตัวนี้สามารถช่วยให้ผู้ทำงานวิจัยใช้อาร์เอ็นเอที่อุณหภูมิห้องได้ หรือใช้ในการขนส่ง หรือกรณีที่จำเป็นต้องมีการ  freeze-thaw บ่อยๆ ทำให้อาร์เอ็นสลายน้อยลง อย่างไรก็ตามต้องมีการกำจัดสารเหล่านี้ออกก่อนจะนำไปใช้ในการนำงานอื่นต่อ

อีกผลิตภัณฑ์คือ RNase inhibitor proteins อาทิ RiboGuard™ เป็นโปรตีนที่ยับยั้ง RNases บางประเภทโดยจับกันในอัตราส่วน 1:1 ประสิทธิภาพของผลิตภัณฑ์ขึ้นอยู่กับปริมาณ RNase ที่ปนเปื้อนในตัวอย่าง หากมีการปนเปื้อนในปริมาณมากอาจกำจัด RNases ได้ไม่หมด ข้อควรระวังบางประการในการใช้สารยับยั้ง RNase เหล่านี้คือสารเหล่านี้อาจมีราคาแพง นอกจากนี้ยังสามารถใช้ glycerol และ DTT แต่อาจส่งผลต่อการทดลองถัดไปได้ หากไม่ประสบผลสำเร็จในการกำจัด RNases แล้วทางบริษัท Biotium ได้พัฒนาผลิตภัณฑ์ที่เป็นเอกสิทธิ์เพื่อหยุดการทำงานของ RNases อย่างถาวรในสารละลาย ภายใต้ชื่อ RNase-Free Calf Thymus DNA

ตรวจวัดเอนไซม์ RNase ในสารที่ใช้กับอาร์เอ็นเอ

โดยทั่วไปหลายบริษัทจะจำหน่ายชุดตรวจเอนไซม์ RNase ที่เป็น  fluorescently-labeled RNA oligo ในการวัดกิจกรรมของเอนไซม์ เช่น RNaseAlert® จาก IDT พบว่าการทดสอบนี้เป็นวิธีที่ดีในการตรวจสอบว่าสารเคมีและบัฟเฟอร์แบบโฮมเมดนั้นปราศจาก RNase อย่างไรก็ตามยังต้องระวังเรื่องค่า pH ความเป็นเกลือที่สูง หรือสารชะล้าง ซึ่งสามารถยับยั้ง fluorescence-based RNase assays ได้

2. การสกัดอาร์เอ็นเอ

สกัดอาร์เอ็นเอจากตัวอย่างเซลล์หรือชิ้นเนื้อ (Isolation from fresh cells or tissues)

สำหรับเซลล์เพาะเลี้ยงและเนื้อเยื่อสามารถสกัดอาร์เอ็นเอได้จากหลายวิธี วิธีดั้งเดิมในการสกัดคือใช้สารฟีนอลและคลอโรฟอร์ม เพื่อแยกโปรตีนและไขมันออกเป็นชั้นอินทรีย์และกรดนิวคลีอิกเป็นชั้นน้ำ กระบวนการนี้สามารถทำได้ภายใต้สภาวะที่เป็นกรดเพื่อเลือกแยก RNA ออกจาก DNA นอกจากนี้ยังใช้ TRI Reagent™ หรือรู้จักในชื่อ TRIzol™ ซึ่งใช้เกลือกวานิดิเนียม (guanidinium salt) ร่วมกับฟีนอลและคลอโรฟอร์มในการคัดแยกอาร์เอ็นเอ

ปัจจุบันนักวิจัยส่วนใหญ่นิยมใช้ชุดสกัด column-based RNA เพื่อหลีกเลี่ยงการใช้ฟีนอลซึ่งเป็นสารเคมีอันตรายและมีเทคนิคที่ซับซ้อน สำหรับผู้ที่มองหาวิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่ง่ายขึ้น Biotium มีชุดสกัดเช่น  CELLDATA RNAstorm™ Fresh Cell and Tissue RNA Isolation Kit ซึ่งใช้เกลือกัวนิดิเนียมและคอลัมน์เมมเบรนซิลิกาเพื่อแยกอาร์เอ็นเอแบบคัดเลือก

อาร์เอ็นเอทั้งหมดที่สกัดได้จากวิธีต่างๆ ประกอบด้วยไรโบโซมอลอาร์เอ็นเอ (Ribosomal RNA) ประมาณ 95% บางการทดลองจะนำอาร์เอ็นเอทั้งหมดไปทำบริสุทธิ์ต่อ แต่อย่างไรก็ตาม mRNA จะแยกได้จาก cellular RNA และเป็นเรื่องยากที่จะบริสูทธิ์ได้ในปริมาณสูงและกำจัด Ribosomal RNA ทั้งหมดออก จึงนิยมใช้วิธีเคลือบเม็ดบีทกับ oligo dT ซึ่งจะจับกับส่วน poly A tails ของ mRNA เพื่อช่วยเพิ่มปริมาณ mRNA ขึ้น

การสกัดอาร์เอ็นเอจากชิ้นเนื้อ FFPE sections

จากความก้าวหน้าทางเทคโนโลยี next-generation sequencing ทำให้มีนักวิจัยหันมาสกัดอาร์เอ็นเอจากชิ้นเนื้อในฟาราฟิน (Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues) มากขึ้น เนื่องจากชิ้นเนื้อจากผู้ป่วยมักเก็บด้วยวิธีนี้ การสกัดอาร์เอ็นเอจากชิ้นเนื้อ FFPE มีความท้าทายมากกว่าการสกัดจากเซลล์ เพราะสารฟอร์มาลดีไฮด์จะเชื่อม RNA กับโปรตีนและตัวมันเอง วิธีในการลดการเชื่อมต่อคือต้องใช้ความร้อนสูง แต่จะส่งผลให้อาร์เอ็นเอได้รับความเสียหายและสกัดได้ปริมาณน้อย

                สำหรับ CELLDATA RNAstorm™ FFPE RNA Extraction Kit เป็นเทคโนโลยีเอกสิทธิ์เพื่อลดการเชื่อมต่อของสารฟอร์มาลดีไฮด์ โดยหลีกเลี่ยงการใช้อุณหภูมิสูงและตัวทำละลายที่เป็นอันตราย ทำให้สกัดอาร์เอ็นเอได้มากขึ้น เมื่อเปรียบเทียบกับชุดแยก FFPE อื่นๆ ตามที่วัดโดยคะแนน RIN หรือโดย DV200 (รูปที่ 3)

3. การตรวจวัดอาร์เอ็นเอ

การหาปริมาณอาร์เอ็นเอ

วิธีทั่วไปที่นิยมใช้ในการวัดปริมาณกรดนิวคลีอิกคือการวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 260 nm (A260) แต่จะไม่สามารถแยกความแตกต่างระหว่างดีเอ็นเอกับอาร์เอ็นเอได้ สำหรับการหาปริมาณอาร์เอ็นเอคำนวณได้จาก ค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 260 nm x 40 จะทราบความเข้มข้นในหน่วย ng/uL และจะทำการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 280 nm เพื่อตรวจสอบการปนเปื้อนของโปรตีน หากอัตราส่วนระหว่าง A260/A280 อยู่ที่ 2.0 หรือมากกว่า แสดงว่าอาร์เอ็นเอมีความบริสุทธิ์ อย่างไรก็ตาม โปรดทราบว่าอัตราส่วน A260/A280 อาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับ pH แนะนำให้ใช้ตัวทำละลายตัวเดียวกันเสมอ เพื่อให้การอ่านค่าการดูดกลืนแสงสอดคล้องกันระหว่างการทดลอง

การทดสอบหาปริมาณอาร์เอ็นเอที่ใช้สีย้อมเรืองแสงเป็นวิธีที่แม่นยำที่สุดในการหาปริมาณอาร์เอ็นเอ เพราะมีความจำเพาะสูงและแม่นยำ นอกจากนี้การทดสอบบางอย่าง (แต่ไม่ใช่ทั้งหมด) ยังมีข้อได้เปรียบในจำเพาะต่อ ssRNA มากกว่า dsDNA ชุดสกัด AccuBlue® Broad Range RNA Quantitation Kit มีความจำเพาะกับอาร์เอ็นเอมากกว่า dsDNA (รูปที่ 4) ควรระวังว่าสีย้อมตรวจจับอาร์เอ็นเอเรืองแสงของบริษัทบางแห่ง เช่น RiboGreen® ไม่จำเพาะต่ออาร์เอ็นเอ และจะตรวจจับ dsDNA ที่มีอยู่ในตัวอย่างด้วย

การตรวจสอบอาร์เอ็นเอบนเจล

 เพื่อทำการตรวจสอบขนาดเบื้องต้นของอาร์เอ็นเอ นิยมนำอาร์เอ็นเอที่สกัดได้ไปรันบนอะกาโรสเจล ในการประเมินด้วยสายตา การเพิ่ม EMBER500™ RNA Prestain Loading Dye ลงในตัวอย่างอาร์เอ็นเอสำหรับการรัน สีย้อมนี้มีความจำเพาะมากกว่า  ethidium bromide สามารถตรวจวัดปริมาณอาร์เอ็นเอที่มีความเข้มข้นต่ำที่ 25 ng (รูปที่ 5)