หมดกังวลในการลืมเติมตัวอย่างสำหรับเทคนิค real-time PCR กับ FORGET-ME-NOT™ qPCR MASTER MIXES

1. EVAGREEN®DYE-BASED QPCR MASTER MIXES

คุณสมบัติ

• สีย้อม EvaGreen® - ให้สัญญาณที่ดีกว่าสีย้อม SYBR® Green ไม่มีความเป็นพิษ ไม่ก่อให้เกิดการกลายพันธุ์และไม่เป็นอันตรายต่อสิ่งมีชีวิตในน้ำ
• มีระบบสี 2 สีในการติดตามตัวอย่างเพื่อช่วยลดความผิดพลาดขณะปิเปตสาร ประหยัดเวลา สารเคมี ตัวอย่างดีเอ็นเอ และค่าใช้จ่าย
• Cheetah™ Hotstart Taq – จะถูกกระตุ้นให้ทำงานได้รวดเร็วภายในเวลา 2 นาทีที่อุณหภูมิ 95°C
• สีย้อมมีแบบไม่มีสีย้อม ROX passive และแบบแยกหลอดของ ROX หรือแบบผสมล่วงหน้าด้วย ROX (ความเข้มข้นสูงหรือต่ำ)

Forget-Me-Not™ EvaGreen® qPCR Master Mixes จัดเป็น hot-start EvaGreen® dye-based master mixes ใช้ในงานวิเคราะห์ด้วยเทคนิค quantitative real-time PCR (qPCR) และการวิเคราะห์ DNA melt curve มีระบบในการติดตามตัวอย่างของดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template) ด้วยการเปลี่ยนแปลงของสี ซึ่งจะผสมสีที่เป็นสารเคมีที่ไม่ว่องไวต่อการทำปฏิกิริยา โดยสีตั้งต้นก่อนเติมตัวอย่างคือสีฟ้า เมื่อเติมตัวอย่างสีจะเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงิน (ดังรูปที่ 1) ซึ่งง่ายต่อการมองเห็นว่าได้เติมตัวอย่างไปแล้ว

รูปที่ 1 แสดงระบบสีที่ใช้การติดตามตัวอย่างดีเอ็นเอต้นแบบของสีย้อม  Forget-Me-Not™ EvaGreen® Master Mix ภาพด้านขวา แสดงสีฟ้าก่อนเติมตัวอย่าง ภาพด้านซ้ายแสดงสีน้ำเงินเมื่อเติมตัวอย่าง

EvaGreen® dye สี EvaGreen® เป็นสี DNA-binding รุ่นใหม่ที่ถูกพัฒนาขึ้นสำหรับงานด้าน qPCR และการวิเคราะห์ High Resolution Melting (HRM) มีกลไกการทำงานคือ “ปล่อยตามความต้องการ” หากไม่มีดีเอ็นเอสีจะอยู่ในรูปแบบไม่พร้อมทำงาน โดยโครงสร้างจะเป็นลูป แต่ถ้ามีดีเอ็นเอสีจะคลายโครงสร้างจากลูปเป็นเส้นตรงและเข้าจับกับดีเอ็นเอและปล่อยแสงเรืองแสงออกมา

รูปที่ 2 แสดงการกลไกการทำงานของสี EvaGreen®

คุณสมบัติเด่นของสี EvaGreen® คือมีความปลอดภัยสูง ส่วนใหญ่สีย้อมที่จับกับดีเอ็นเอ (DNA-binding) มักทำให้เกิดการกลายพันธ์ แต่อยากการพัฒนาวิจัยของนักวิทศาสตร์ในทีมของ Biotium สี EvaGreen® ไม่สามารถจับกับเยื้อหุ้มเมมเบรนได้ จึงเป็นการป้องกันจีโนมดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตไม่ให้ถูกทำลาย และยังปลอดภัยต่อสิ่งมีชีวิตในน้ำ กรณีกำจัดโดยตรงในท่อระบายน้ำ นอกจากนี้หากต้องนำ PCR product ไปวิเคราะห์ต่อด้วยเทคนิค gel electrophoresis ไม่จำเป็นต้องผสมกับสีย้อมอื่นๆ อีก เพราะสี EvaGreen® เป็น DNA pre-stain ได้ เมื่อรัน electrophoresis จะมองเห็นแถบของดีเอ็นเอได้

รูปที่ 3 แสดงภาพความปลอดภัยของสี EvaGreen®

สีย้อม PCR จะปล่อยแสงเรืองแสงโดยสร้างสารเชิงซ้อนระหว่าง DNA กับสีย้อม ซึ่ง dye-DNA complex ย่อมรบกวนปฏิกิริยา PCR อย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ การยับยั้งปฏิกิริยา PCR โดยสีย้อมอาจรุนแรงเป็นพิเศษในขั้นตอนแรกของปฏิกิริยา PCR ซึ่งอัตราส่วนของสีย้อมต่อ DNA สูง ในทางกลับกัน ความเข้มข้นของสีย้อมที่เพียงพอเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการสร้างสัญญาณที่ดี ดังนั้นต้องใช้ความเข้มข้นของสีย้อมที่เหมาะสมที่สุดเพื่อให้ได้ประสิทธิภาพ PCR ที่เชื่อถือได้ ในกรณีของสีย้อม SYBR® Green I ความเข้มข้นของสีย้อมที่เหมาะสมที่สุดอาจค่อนข้างต่ำ ซึ่งจำกัดสัญญาณ PCR และทำให้สีย้อมไม่เหมาะสำหรับการวิเคราะห์ด้วย High Resolution Melting® นอกจากนี้ที่มีความเข้มข้นของ SYBR® Green ต่ำอาจเกิดความล้มเหลวในการตรวจจับแอมพลิคอนหลายตัวโดยจุดหลอมเหลวสูงสุด ทำให้ได้ผลลัพธ์

Cheetah™ HotStart Taq เป็นกรรมสิทธิ์ของ Biotium ที่ปรับปรุงจาก hot-start DNA Polymerase ออกแบบไม่ให้เกิดการทำงานของเอนไซม์ที่อุณหภูมิห้อง แต่จะเริ่มทำงานหลังจากปฏิกิริยา PCR ที่อุณหภูมิ 95°C ไปแล้ว 2 นาที เหมาะสำหรับการทำ fast cycling PCR

2.UNIVERSAL PROBE QPCR MASTER MIX

Forget-Me-Not™ Universal Probe qPCR Master Mix เป็นผลิตภัณฑ์สำหรับใช้ในงาน fluorescent probe-based PCRประกอบด้วย hydrolysis probes เช่น TaqMan® และ dual-labeled BHQ® probes และ displacement probes ผลิตภัณฑ์ดังกล่าวแสดงผลลัพธ์ที่ดีและสอดคล้องกันในการทำปฏิกิริยา singleplex และ multiplex reactions แบบ broad instrument ซึ่งสามารถใช้ได้กับวิธีมาตรฐานและ fast protocol ในชุดทดสอบประกอบด้วย 40X Forget-Me-Not™ Tracking Buffer ผสมสีที่เป็นสารเคมีที่ไม่ว่องไวต่อการทำปฏิกิริยาคือสีฟ้า มีตัวเลือกในการติดตามว่าได้เติมตัวอย่างดีเอ็นเอแล้วหรือไม่ ที่ช่วยให้การทำปฏิกิริยา PCR เป็นเรื่องง่ายขึ้น

3. คู่มือการเลือก Master Mix

*Optional

ที่มา : Forget-Me-Not™ qPCR Master Mixes - Biotium